RNA表观遗传学修饰越来越受到科学家们的重视，成为近来生命科学领域的研究热点之一。迄今为止，在RNA上已经发现170多种表观遗传修饰，他们在基因调控、mRNA剪接和RNA折叠等生命过程中发挥着至关重要作用，还与癌症、中风等人类疾病的发生密切相关。然而，目前主流的二代测序方法可检测的修饰种类有限，且这些方法通常只能鉴定其中一种修饰类型，仍有大量RNA修饰无法被检测或被定位。新兴的纳米孔测序技术可直接对长链RNA进行测序，无需逆转录和PCR扩增，有望直接读取RNA上的修饰信息。但受限于有限的孔道分辨率，修饰核苷酸引起的离子电流变化还容易受到相邻位置的影响，这为准确判断修饰的位置和多种修饰的同时检测带来了困难。

近日，我院生命分析化学国家重点实验室黄硕课题组构建了一种超高分辨的工程化纳米孔，可以准确的识别所有RNA核苷酸和他们的主要修饰。该工作对八聚体耻垢分枝杆菌膜蛋白A (MspA) 纳米孔的其中一个单体理性设计，进而在孔道内最灵敏的识别位点精准引入了唯一的苯硼酸适配器，实现了四种经典核苷酸（C, U, A, G）, 5-甲基胞苷(m5C)， N6 -甲基腺苷(m6A)， N7 -甲基鸟苷(m7G)， N1 -甲基腺苷(m1A)，肌苷(I)，假尿嘧啶(Ψ)和二氢尿嘧啶(D)的完全区分与同时检测，机器学习识别准确率高达99.6%。

图1: 利用高分辨MspA纳米孔区分RNA核苷酸及其表观遗传学修饰

随后该团队开发了基于酶切的天然RNA修饰检测方法，通过核酸外切酶将目标RNA剪切为单核苷酸，并利用纳米孔对单核苷酸进行鉴定和定量分析，以此成功绘制胃肠癌标志物miRNA和酵母tRNA的修饰图谱。该研究方法适用于各种核苷酸、核苷酸修饰及核苷酸衍生物的检测，为快速、全面分析天然RNA中的表观修饰提供高分辨单分子分析工具，并为发展边酶切边测序的纳米孔RNA表观遗传测序提供了重要的设计策略和研究方法。

图2: 天然酵母苯丙氨酸tRNA修饰图谱

该工作以“Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore”为题，于2022年7月18日发表在《Nature Nanotechnology》（文章链接：https://www.nature.com/articles/s41565-022-01169-2，DOI：https://doi.org/10.1038/s41565-022-01169-2）。我院博士后王玉琴、博士生张善雨和贾文东为该论文共同第一作者，我院黄硕教授为论文通讯作者，陈洪渊院士对该工作做出了重要指导。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，国家自然科学基金（项目编号：31972917，91753108，21675083）、中央高校基本科研业务费资助项目（项目编号：020514380257，020514380261）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京老员工命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）、南京大学科技创新基金资助项目、中国博士后科学基金资助项目（项目编号：2021M691508）等经费支持。