纳米孔道蛋白质单分子测序技术的关键问题之一是如何提高现有纳米孔道传感界面的空间分辨能力。近日，南京大学龙亿涛教授团队与北京大学陈鹏教授团队通过长期的共同合作与探索，将基于吡咯赖氨酸的遗传密码子扩展技术应用于Aerolysin纳米孔道界面。经过4年的摸索及体系优化，实现将非天然氨基酸高效地引入了纳米孔道的传感区域内，从而设计调控了孔道识别灵敏域内每一个氨基酸残基的空间取向，获得了三维化学及物理环境可控的蛋白质孔道界面，有效提高了纳米孔道对单个多肽分子的空间分辨能力（图1）。

图1. 非天然氨基酸构建的纳米孔道灵敏域用于多肽单分子分析。

双方团队通过筛选高效的氨酰tRNA合成酶和优化Aerolysin蛋白的表达条件，将非天然氨基酸插入的成孔蛋白产量提高至5 mg/L（图2）。大量重复实验表明，该成孔蛋白的开孔电流标准差与野生型孔道蛋白相当，证明了遗传密码子扩展技术的高产物均一性。

图2.非天然氨基酸编码的Aerolysin成孔蛋白高表达体系。

进一步，通过分子动力学模拟和纳米孔道单分子电化学实验研究了非天然氨基酸构建的传感区域。相较于天然疏水氨基酸残基在Aerolysin孔道内的贴壁行为，较长的芳香族非天然氨基酸侧链在孔道内呈现有利于多肽检测的立体几何构象，形成一个针对多肽上芳香族氨基酸识别的传感灵敏域。该非天然氨基酸构建的纳米孔道将单个多肽分子在孔道内的阻断时间延长了十倍，实现了对混合样品中不同长度多肽分子的精准区分（图3）。

图3.非天然氨基酸构建纳米孔道的全原子模型以及多肽单分子分析。

该方法突破了传统生物纳米孔道修饰方法的局限，建立了非天然氨基酸编码的成孔蛋白高表达体系，为用于多肽测序的超灵敏纳米孔道的理性设计开辟了新道路。

相关成果以“Controlled Genetic Encoding of Unnatural Amino Acid in Protein Nanopore.”为题，发表于德国应用化学（Angewandte Chemie International Edition）, DOI： 10.1002/anie.202300582, 文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202300582。我院博士后武雪原博士为论文第一作者,应佚伦教授和北京大学陈鹏教授为论文的共同通讯作者，该工作得到了科技部国家重点研发计划（2022YFA1304604）、国家自然科学基金（22027806和22090050）及中国博士后科学基金（2021M691509）的资助。