在自然界中，巯基-二硫键的相互转化在维持蛋白质结构及功能方面具有重要意义。然而，对于蛋白质限域环境中氧气如何介导巯基-二硫键的相互转化机制还尚不明晰，其主要困难在于缺乏可以控制蛋白质限域氧气环境的单分子化学反应实时分析技术，来跟踪观测单个二硫键形成及断裂过程。

我院龙亿涛、应佚伦教授团队多年聚焦于纳米孔道单分子测量仪器研制和分析方法创新。近日，利用自主研制的高带宽微弱电流测量系统，在专业手套箱中搭建了可实时控制限域氧气环境的纳米孔道单分子化学反应测量装置。采用氨基酸定点突变技术引入单个巯基活性基团的反应位点，通过Aerolysin(气单胞菌溶素)膜孔自组装特性，构建纳米孔道内单分子反应的限域可控环境，实时、高通量地获取了氧气介导的可逆巯基-二硫键转化过程。通过分析不同溶解氧、临近氨基酸条件下的巯基-二硫键转化路径，结合单分子动力学计算，提出了质子、氧气共同介导的限域二硫键断裂新机制。

图1 可控氧纳米孔道单分子化学反应测量装置和不同溶解氧条件下的单个二硫键形成及断裂的实时监测过程

首先，通过在手套箱中改变氧分压实现调控反应环境氧气浓度，实时监测了限域纳米孔道内不同氧气浓度条件下的单个二硫键形成和断裂，获得单个二硫键形成和断裂的间隔时间以计算单分子反应速率。实验结果显示，在+50 mV电压下，随着溶解氧浓度从6.3 mg/L降低到<0.1 mg/L，二硫键的形成速率未发生明显变化，而其断裂速率明显降低（图1）。动力学计算表明，在溶解氧浓度为6.3 mg/L时，蛋白质孔道单分子反应器中氧气介导的二硫键形成速率常数比宏观溶液体系提高了6个数量级，与硫氧还蛋白中巯基的氧化反应速率常数相当。这种原位实时得到的单个巯基反应数据进一步证实了蛋白质限域环境可显著提高化学反应速率。

图2 氧气介导的蛋白质巯基-二硫键转化动力学

进一步，利用该分析方法获得了不同电压下巯基-二硫键转化中各步骤反应的速率常数，推导了无电压条件下即蛋白质分子原位限域环境中巯基-二硫键转化过程的各步速率常数，发现氧气和质子共同参与了限域二硫键的断裂过程。据此提出了氧气介导的二硫键断裂反应路径，并在单分子水平上计算出该过程的反应级数（图2）。利用该机制，通过移除蛋白质反应位点临近的负电荷氨基酸，团队构建了新型纳米孔道G234C Aerolysin反应器，将氧气介导的二硫键断裂速率降低了近40倍（图3），有效增加了限域条件下二硫键的稳定性。

图3 改变反应位点电荷微环境对巯基/二硫键转化的动力学影响

纳米孔道单分子化学反应测量装置可用于溶液体系下不同反应微环境的单分子反应过程精准测量，为化学反应的监测提供了一种单分子反应原位测量新方法。相关成果以“Observing Confined Local Oxygen-Induced Reversible Thiol/Disulfide Cycle with a Protein Nanopore”为题，在线发表于Angewandte Chemie International Edition（DOI：10.1002/anie.202304023，VIP Paper）。我院博士生刘威、杨超男和硕士生杨忠林为论文共同第一作者，应佚伦教授为论文通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金（21834001 和22090050）及南京大学优秀博士研究生项目（202201B027）的资助。

文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202304023