单分子检测技术具有超高灵敏度、良好选择性、快速分析和低样品消耗等显著优点，是一种可快速且简单地鉴定低浓度分子的理想方法。生物纳米孔作为一种易改造的单分子检测工具，广泛用于识别各类分子，包括DNA，RNA，蛋白质，碳水化合物和金属离子等。目前已经报道了生物和化学的方法来拓展纳米孔的应用，如利用定点突变、巯基化学等。如何更为灵活的操纵纳米孔的构建，从而拓展单分子检测的应用范围，已成为该领域的研究热点。
生物体可以通过20种天然氨基酸进行编码和执行生理功能，但仅限于这些氨基酸对于改造蛋白质的结构和扩展蛋白质功能是远远不够的。遗传密码扩展技术（GCE）是利用一对正交的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA将非天然氨基酸（UAA）位点特异性的引入到蛋白质上，可用于原核、真核细胞、动物等体系中蛋白质生化功能的研究。此外，2022年的诺贝尔化学奖颁给了“点击化学和生物正交”，生物正交化学代表了一类高产的化学反应，在生物环境中能够快速且有选择性地进行，成为了生物分子可视化和分析强有力的工具。一些含有生物正交反应基团的非天然氨基酸的出现，极大地拓展了其应用场景。
那么是否可以开发一种“可点击”的生物纳米孔，赋予纳米孔新的功能呢？近日，我院黄硕教授课题组和谢然教授课题组合作在《德国应用化学》期刊首次报道了利用遗传密码扩展技术快速、有效地将生物正交反应基团引入到耻垢分枝杆菌膜蛋白A (MspA) 纳米孔顶端。野生型MspA纳米孔是天然的八聚体，作者利用正交性的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA将含有叠氮基团的非天然氨基酸AzK引入到MspA的特定位点（D56），并通过凝胶电泳、质谱分析以及单通道电流表征，证实含有叠氮化物的八聚体M2 MspA-D56AzK已被成功制备（图1）。为了展现GCE技术在纳米孔中的通用性以及纳米孔与各种类型非天然氨基酸的兼容性，作者也成功将含有炔基的非天然氨基酸AlkK引入到MspA的特定位点中。
图1. MspA中位点特异性引入非天然氨基酸
为了验证所引入非天然氨基酸的反应活性，作者通过点击反应成功将DBCO（二苯并环辛炔）-官能化的单链DNA或溶菌酶偶联到纳米孔道的顶端，并在单分子水平实时观测这些生物大分子的运动。特别地是，含有溶菌酶的嵌合型纳米孔可以对溶菌酶的寡糖底物进行传感，实现了N-乙酰壳三糖（NAG3），N-乙酰壳六糖（NAG6）的同时检测和清晰区分（图2）。这种酶-纳米孔偶联策略允许实时监测酶促反应，提供更多的动态信息和测量连续性。
图2. 溶菌酶嵌合纳米孔与不同底物相互作用的单分子观测
该工作以“Site-Specific Introduction of Bioorthogonal Handles to Nanopores by Genetic Code Expansion”为题，于2023年3月16日在《Angewandte Chemie International Edition》发表相关论文（文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202216115，DOI: 10.1002/anie.202216115）。我院黄硕教授和谢然教授为该论文的共同通讯作者，谢然课题组博士生杨晶和黄硕课题组博士生王可凡为该论文的共同第一作者。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，以及科技部国家重点研发计划（项目编号：2022YFA1304602）、国家自然科学基金（项目编号：2207070006,22225405和31972917）、中央高校基本科研业务费资助项目（项目编号：020514380257）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009和BK20202299）、南京大学优秀科研项目（项目编号：ZYJH004）、上海市市级科技重大专项、南京老员工命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM2204）、中国博士后科学基金资助项目（项目编号：2021M691508, 2022T150308）等经费支持。