在生命起源研究中，“RNA世界”（The RNA World）是目前影响最大的假说之一，即存在一个早期生命体系，由RNA同时承载遗传编码和实施催化功能。“RNA世界”假说虽然受众较广，但其中多个核心问题尚未解决，如核糖的生成、碱基的形成、核苷化、磷酸化和核苷酸的聚合。在核苷化这一关键步骤中，由于嘌呤N9位和嘧啶N1极弱的亲核性，使得碱基和核糖直接缩合形成糖苷键成为困扰研究者们的难题。自1970年代Leslie Orgel开始探索核苷化以来，该反应一直存在产率低、选择性差、与原始地球环境不符等挑战。对于嘌呤而言，糖苷键优先形成于NC6位而非RNA中的N9位，而嘧啶的直接核苷化几乎没有先例（图1）。
图1.“RNA世界”假说中的糖苷化问题
威尼斯wnsr888王晓课题组一直致力于生命起源研究及其和现代化学技术的结合（Nat. Catal. 2019, 2, 98–102）。在前期研究中，针对核糖的自然选择这一生命起源中的重要难题，提出并证明了遍布地壳的黏土及其吸附的金属离子（MDC）可作为一个“天然固定相”，将核糖从复杂的混合糖中分离出来，并采用模块化的流动化学系统模拟了MDC动态吸附核糖的过程（Chem 2021, 7, 3292–3308）。对于碱基的核苷化，借助微通道反应器发现了空化效应对于嘌呤核苷N9选择性的促进作用，反应以水分子作为催化剂，为实现绿色糖苷化提供了新思路（Cell Rep. Phys. Sci. 2021, 2, 100375）。近日，王晓课题组在核苷的前生物合成方面取得新进展，发现了金红石、锐钛矿及各种钛酸盐对核苷化的区域选择性有极大的提升作用。以此为基础，深入研究了原始地球环境下核糖和嘌呤或嘧啶碱基的缩合反应，首次实现了对N9位（嘌呤）和N1位（嘧啶）的选择性核苷化，也借此发展出一种无需保护基团的水相糖苷化方法，相关成果发表于Nature Synthesis。
在探索核苷化问题的过程中，作者通过调研，发现已报道的核苷化反应中均添加了可溶性离子来模拟原始海水，如NH4+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Mn2+等，但未曾使用过不溶性矿物。TiO2是用途广泛的非均相催化剂，且钛元素在地壳中质量丰度为0.63%，位列第九，在原始地壳中也应大量存在，引起了作者的关注。TiO2表面具有酸性（Ti）和碱性（O）位点，或许有助于同时活化核糖和碱基以生成糖苷键。因此，作者研究了常见含钛矿物存在下的一系列核苷化反应。
首先，作者初步尝试了钛铁矿（FeTiO3）存在下的腺嘌呤核苷化，在pH = 1，75°C下将反应混合物敞口蒸干。腺嘌呤核苷化理论上可生成8种产物异构体（图1），故完善的产物分析是开展该项工作的先决条件。通过总离子色谱（TIC，图2b）和密度泛函理论计算（DFT，图2c）验证，作者初步确定了AN9和ANC6这两类产物的分组。随后，将反应混合物与Carell课题组提出的间接路线的产物（Science 2016, 352, 833）以及α-腺苷和β-腺苷标样做混合进样，进一步确定了4种AN9异构体。最后，用制备级色谱柱分离出各个产物，通过1H NMR完全确认了3种ANC6异构体和4种AN9异构体。可喜的是，该反应具有极高的N9产率（∑AN9 = 8.9%）和前所未有的∑AN9/∑ANC6比率（1.1/1）。
图2. FeTiO3促进的腺嘌呤核苷化及AN9异构体的几何优化
作者继而探索了在原始地球的“湿干循环”条件下，各种钛矿对于核苷化的促进作用。作者尝试采用不同类型的二氧化钛（金红石和锐钛矿）和钛酸盐（CaTiO3和FeTiO3），在更温和的温度下（70°C）将水蒸干，再补充水至原体积，于70°C下再次蒸干。重复循环9轮，每轮循环后测定反应产率和选择性（图3a-d）。结果显示，金红石和锐钛矿对于N9核苷化展现出较高活性（∑AN9分别为13.9%和13.4%），而FeTiO3和CaTiO3则活性略低（∑AN9为12.7%和12.9%）。除了实现比单次蒸干更高的∑AN9/∑ANC6比率（13:1）外，还生成了很多β-腺苷（3.6%）。此外，作者开展了有/无钛矿的对照实验，以及FeTiO3/FeCl2的对照实验，证明了钛矿对于N9选择性有着不可或缺的作用。
接下来，作者将上述反应条件用于鸟嘌呤和尿嘧啶的核苷化。鸟嘌呤核苷化存在12种可能的产物，增加了产物分析的难度。为此，作者将反应混合物与Carell路线的产物及β-鸟苷标样分别混合进样，通过TIC确定了4种GN9产物。经历9轮湿干循环后，金红石和FeTiO3催化的反应中∑GN9分别保持在15%和10%左右，而两组反应分别获得5%和6%的β-鸟苷（图3e-f）。此外，作者还尝试仅在1次蒸干后就将反应混合物置于50 °C和pH 10之下，使双核苷化产物选择性水解，10天后的∑GN9高达19%，而β-鸟苷产率高达6.7%，这也是迄今为止β-鸟苷的前生物合成所能达到的最高产率。对于尿嘧啶的反应，高分辨质谱（HRMS）显示有核苷化产物生成，而LC-MS和TIC进一步显示有少量β-尿苷生成，尽管其产率很低，但意义依旧重大。
图3. 湿干循环条件下钛矿促进的碱基糖苷化产率和选择性
考虑到原始地球环境下质子浓度有限，对于需要一定酸性的核苷化反应而言，将质子保存在矿物表面显得尤其重要。因此，作者对钛矿吸附质子的能力进行了定量探究（图4a），在有/无钛矿存在的条件下，分别蒸干pH = 3的盐酸溶液，加水稀释后，含有钛矿的溶液pH值比无钛矿的溶液低0.4至0.8，证明了钛矿具有吸附质子的能力（图4b-c）。由此证明，起始溶液不必具有强酸性，对于非挥发性的酸（如磷酸）更是如此。因此，作者以pH = 4为起始条件尝试腺嘌呤的核苷化（图4d），在7轮湿干循环后，依然得到不错的结果，∑AN9达到11.6%，β-腺苷产率达2.6%。
图4. 钛矿吸附质子实验
最后，作者研究了该反应可能存在的多种机理（图5a）。在酸和钛矿的作用下，碱基与核糖发生直接糖苷化生成N9核苷（路径1），或NC6产物（路径2），或双核苷化产物（路径3）。经实验证明，早期湿干循环中，N9核苷的产率升高应归因于路径1中酸和钛矿的共同促进作用。但在后期循环中，N9核苷的增长与NC6产物的消耗基本持平，因此作者推断存在路径2，即NC6产物水解后，在钛矿作用下重组生成更稳定的N9核苷。对照实验证明，钛矿对路径2的发生有明显的促进作用（图5b）。而LC-MS和TIC数据证明了双核苷化产物的存在（路径3）。为进一步阐释机理，作者通过红外光谱（图5c）和X射线光电子能谱（图5d），研究了嘌呤、嘌呤二氧化钛混合物、嘌呤氧化铝混合物的光谱特征，分析了钛矿和嘌呤间可能存在的特殊作用，以解释钛矿对N9区域选择性的提升。
图5. 核苷化的三种路径和机理研究
综上所述，王晓课题组报道了一类钛矿促进的区域选择性核苷化反应，填补了“RNA世界”假说中的一项空白，同时开发了一种无保护基团的水相合成糖苷键的绿色化学方法。在含钛矿物的作用下，N9腺苷可实现14%的总产率（其中β-腺苷达3.6%），且具备优异的区域选择性（N9/NC6达13:1）。对于鸟嘌呤，实现了β-鸟苷迄今为止的最高产率（6.7%）。对于N1位亲核性极弱的嘧啶类碱基，也检测到了核苷化产物。这项研究表明，采用特定的不溶性矿物，能够极大地影响核苷化反应的产物分布；之前观测到的NC6产物占主导很有可能是动力学因素导致。而N9核苷之所以成为RNA的主体并延绵至今，是因为它的热力学稳定性。在矿物的作用下，漫长的地质年代会将动力学产物逐渐转变为热力学产物。
相关成果以“Regioselective ribonucleoside synthesis through Ti-catalysed ribosylation of nucleobases”为题发表于Nature Synthesis（DOI:10.1038/s44160-022-00206-1）。2019级硕士研究生（2022级博士研究生）陈倩倩为该论文的第一作者，2020级博士研究生赵泽润和研究助理叶尔森•帕特合别克为该项工作做了重要贡献，王晓副教授为通讯作者。
